Justificación
Esta propuesta de trabajo de grado, está encaminada a evaluar parámetros específicos, en el desarrollo de herramientas para reconstrucción de imágenes moleculares, dicha evaluación aportará lineamientos de diseño en base a modelos existentes, para la futura implementación de un escáner de fotones, como parte del trabajo que adelanta el Centro de Microscopia Electrónica de la Pontificia Universidad Javeriana la investigación que ha adelantado dicho centro está enfocada al procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopia.
El desarrollo de la base matemática para este sistema, simulando cada uno de los eventos que suceden durante la emisión, detección y procesamiento de una señal, teniendo en cuenta las diversas condiciones de funcionamiento y el objetivo de obtener información valida derivada de una muestra biológica, brindarán información necesaria, que permita realizar un montaje optimizado con los recursos disponibles, por consiguiente es un desarrollo que podrá ser continuado .
Otro de los alcances de dicha evaluación para la comunidad educativa, es poner a disposición un desarrollo cuantitativo que se incluya en las diversas investigaciones al respecto en microscopia electrónica.
Las oportunidades y beneficios con respecto al análisis técnico por el método de variables aleatorias, permiten simular una cantidad finita considerable de eventos, que reducen el error en la toma de datos durante la detección de la fuente, esto se representará en costo y tiempo durante la implementación
El análisis del comportamiento de una célula sobre un microscopio desde el punto de vista de implementación electrónica, se puede abordar desde el procesamiento de la señal o desde la reacción en la emisión de fotones y captura del fotodetector, en este caso se podrá estudiar a fondo e funcionamiento de un fotomultiplicador explicando sus características relevantes para esta aplicación.
Actualmente existen equipos de microscopía que realizan el procesamiento de la señal tridimensional pero por su costo elevado, el acceso a dicho recurso es limitado, el propósito general del proyecto es implementar de forma básica un prototipo que realice el modelamiento molecular digital con una calidad aceptable con respecto a los equipos del mercado, así, se podrá acceder de forma masiva a información detallada para investigaciones en ciencias.
Esta tesis enmarcada dentro del macroproyecto en torno a la reconstrucción de imágenes moleculares tridimensionales, pretende entonces modelar y concluir en cada uno de los procesos presentes emisión, detección y procesamiento, de acuerdo a los recursos disponibles, utilizando el método de simulación de Montecarlo con modelos validos existentes de cada una de las etapas mencionadas anteriormente.
Objetivo general
Evaluar los parámetros físicos y matemáticos, presentes en un escáner de fotones, que permitan reconstruir digitalmente una imagen de la estructura molecular, proveniente de una muestra biológica impactada por un haz de luz en el rango visible, utilizando un fotomultiplicador tipo side on para su detección y simulando el sistema a través del método de Montecarlo para generar la secuencia aleatoria de eventos.
Objetivos específicos
• Definir que procesos son estocásticos y no estocásticos en el funcionamiento de un escáner de fotones.
• Determinar las variables dependientes e independientes del sistema a evaluar definiendo cada uno de los parámetros que se tendrán en cuenta en la simulación del sistema.
• Definir los modelos comprobados y existentes que determinen el funcionamiento de las etapas presentes en el escáner de fotones.
• Realizar la investigación en base a los avances actuales en la reconstrucción de imágenes tridimensionales del laboratorio de Microscopia de la Pontificia Universidad Javeriana.
• Evaluar los diferentes resultados del método de Montecarlo para simular los eventos presentes en el sistema de forma aleatoria.
• Concluir respecto a los modelos, cuales son las reglas principales y lineamiento de construcción para la reconstrucción de imágenes moleculares para microscopía.
• Especificar los elementos necesarios en cuanto a geometría, óptica y electrónica para el diseño e implementación de un escáner de fotones.
Descripción del proyecto
Se propone la evaluación de un modelo paramétrico para determinar que tipo de información en un escáner de fotones después de la detección de la emisión de luz es válida, para reconstruir digitalmente la estructura molecular de una muestra biológica inducida por laser, con una longitud de onda () fija conocida, como se menciono en la detección de fotones de fluorescencia emitidos por dicha muestra.
La imagen completa de la muestra sólo se consigue mediante la exploración punto por punto, para lo cual debe desplazarse el punto luminoso o la muestra. Ambas posibilidades han conducido al desarrollo de dos tipos diferentes de microscopios:
• Microscopios con base móvil (barrido en etapas): la base con la muestra se desplaza tras cada exposición mientras que el sistema óptico permanece quieto.
• Microscopios con técnica de rayo o de espejo: el punto luminoso se desplaza sobre la muestra que se encuentra fija y la recorre punto por punto con ayuda de pequeños y rápidos espejos accionados mediante un galvanómetro.
En este caso particular la fuente se moverá de modo que la exploración se realiza a través de un escaneo de la muestra y posteriormente tendrá diversos niveles de profundidad dando como resultado imágenes notablemente superiores a las que se obtienen con el microscopio óptico convencional, ya que las imágenes generadas contienen detalles volumétricos y de textura, recogiendo una secuencia de cortes ópticos de la muestra como lote de imágenes y su posterior procesamiento digital presenta la ventaja de este bloque de datos de varias dimensiones, generando una imagen bidimensional calculada (proyección) o una representación reducida en 3 dimensiones de la muestra después un análisis propio del set de datos.
Modelo muestra biológica
El fundamento reside en la radiación producida sobre la materia, cuando un sistema en su estado fundamental, es decir de menor energía, es expuesto a una energía de una magnitud determinada, este puede absorberla pasando a un estado de mayor energía o excitación, la inestabilidad generada en el átomo al ser excitado, lo obliga a producir saltos de electrones de los niveles más externos para cubrir el hueco y volver a su estado fundamental, esto genera un desprendimiento de energía en forma de radiación, cuya longitud de onda dependerá de la diferencia de energía entre los niveles involucrados.
A continuación se muestra el fundamento de las técnicas espectrométricas, proveniente de un sistema atómico como se enunciaba anteriormente, con distintos niveles de energía y posibles transiciones entre ellos, el propósito final es aplicar un modelo estocástico valido que permita modelar la muestra impactada.
En la figura 2.a, se muestra un modelo simplificado del átomo donde existen n niveles energéticos con igual número de capas con sus respectivos electrones, en la figura 2.b se presenta una interacción de un fotón energético con una energía mayor que el electrón de la primer capa, este es excitado y es promovido a una capa externa o expulsado del átomo, a su vez el fotón energético es reducido o gastado (figura 2.c), probablemente un electrón de una capa superior se transfiere (figura 2.d) y finalmente la energía potencial en exceso de la transferencia de una capa a otra se convierte en un fotón (figura 2.e)
Se puede afirmar con lo anterior que la información que se tenga en el momento presente o actual es la única información necesaria para determinar valores futuros esperados, siguiendo un proceso de Markov característico, es decir, la distribución de probabilidad de todos los valores futuros depende únicamente de su valor actual.
También se puede analizar que la muestra al ser impactada presenta incrementos independientes, es decir, que los cambios en el proceso en cualquier intervalo temporal es independiente de cualquier otro intervalo, porque la reacción que sucede en el exceso de transferencia sucede una única vez.
Se utilizara entonces para modelar la muestra biológica, un proceso estocástico de tiempo continuo aleatorio, se estudia un proceso de Wiener por cumplir las propiedades siguientes:
1. Es un proceso de Markov con una media nula y una varianza igual a la unidad φ(0,1)
2. Tiene incrementos independientes donde las variaciones de la variable aleatoria (números de fotones emitidos) f para intervalos de tiempo t cualquiera son independientes
3. Las variaciones en el proceso (f) producidas en un intervalo finito de tiempo (t) se distribuyen normalmente, con una varianza que aumenta linealmente con el intervalo temporal. Por tanto, f = εt (donde ε es una variable aleatoria del tipo φ[0,1])
Evaluación paramétrica
El modelo paramétrico del sistema consta de 3 etapas, definidas por el funcionamiento típico de un escáner de fotones: emisión, recepción/detección y procesamiento, para determinar si la información detectada por un fotomultiplicador y procesada posteriormente permite reconstruir la estructura molecular de la respuesta fluorescente de una muestra biológica impactada por un haz de luz
Variables independientes
• Fuente Emisora de longitud de onda () conocida, con trayectoria de impacto sobre la muestra fija y constante.
• Geometría del sensor y ubicación espacial de la muestra en los ejes X, Y y Z
• Foto detector (Fotomultiplicador R105 tipo Side on) en el rango visible (300 m – 650 m) con una radiación máxima en el cátodo a 400 m de 48 mA/W de acuerdo a especificaciones del fabricante.
Variables dependientes
• Fluorescencia de la muestra
• Numero de fotones detectados
• Ruido: Ruido fotónico, Corriente oscura, Ruido Blanco, Ruido de lectura
• Foto detección: Eficiencia cuántica, Responsividad, Tiempo de respuesta, S/N.
Método de integración numérica de Montecarlo
Teniendo en cuenta cada uno de los modelos y el objetivo de capturar datos que después de su procesamiento permitan reconstruir un punto de luz emitido por la muestra, a través de la herramienta MATLAB se generará una secuencia de números pseudo-aleatorios discretizando la señal de salida del foto detector, utilizando integración numérica.
Está técnica permitirá obtener muestras aleatorias simples en nuestro caso del número de fotones que ingresan al fotodetector y la cantidad de eventos que se procesan como datos validos, conociendo a partir de su función de distribución (F), la ley de probabilidad, repitiendo el proceso n veces, para así obtener la probabilidad de sucesos, esperanzas matemáticas, variaciones de variables aleatorias presentes y demás características que presenten interés en el objetivo de esta disertación académica.
Palabras clave
Imagen molecular y celular / Molecular and cellular imaging, Microscopia / Microscopy, Imagen Fluorescente / Fluorescence image, Imágenes y modelos animales / Animal models and imaging, Reconstrucción de imágenes – Métodos iterativos /Image reconstruction – iterative methods, Métodos estadísticos y probabilísticos / Probabilistic and statistical methods, Monte Carlo, Modelo de Markov / Markov Model, Eficiencia luminosa de una fuente / Luminous efficiency of a source, Eficiencia cuántica interna / Internal quantum efficiency
Bibliografía y fuentes de información
DAZA FIGUEREDO, Jesús Arnoldo. Diseño e implementación de un método de procesamiento y reconstrucción tridimensional de imágenes para microscopía. Bogotá, 2009. Tesis Maestría (Maestría en biología). Pontificia Universidad Javeriana. Departamento de Ciencias.
Espectroscopía de la Fluorescencia molecular.
GONZALEZ, F. Técnicas Experimentales en Investigación : Óptica; España, 2008
GOMEZ CADENA, JJ. “El Método de Montecarlo”. Internet:
HAMAMATSU. Photomultipliers Tubes, Basics and applications, 3a edición. Internet:
MASCAREÑAS, Juan. Procesos Estocásticos: El Proceso de Wiener. Madrid: Universidad Complutense de Madrid, 2008, 12 pag.
MÜHLPFORDT, Henry. Fluorescense Filters, 2009
SANCHEZ RODRIGUEZ, Maria Isabel. Estimación de señales a partir de observaciones inciertas y observaciones retrasadas aleatoriamente. Granada, 2005. 161 p. Tesis doctoral (Doctorado de Estadística) , Universidad de Granada. Departamento de Estadística e Investigación Operativa.